Proteine ​​metodi di isolamento

Le proteine ​​sono isolate da cellule o tessuti polverizzati . Una volta che la cellula è rotto aperto , al suo contenuto o lisato sono raccolti per ulteriore purificazione basato sulle proprietà della proteina , come la sua dimensione , carica e specifici per affinità di legame . Anche se esistono molti protocolli tecnici , ci sono alcuni metodi utilizzati di routine .
proteine ​​sono regolarmente e facilmente isolato utilizzando tecniche ben consolidate in diversi contesti biologici e farmaceutici .
dialisi

Questo metodo comporta il filtraggio di un lisato o proteina soluzione diluita attraverso un semi -permeable membrana , in modo che le proteine ​​più grandi del diametro dei pori punteggiano la superficie della membrana conservati e solo quelli piccoli vengono estrusi . La dialisi può anche essere utilizzato per concentrare la soluzione proteica ; Tuttavia , perché questo metodo non può differenziarsi in modo efficiente le proteine ​​, è spesso seguita da altre tecniche più specifiche . Sistemi automatizzati ora esistono che possono svolgere la dialisi , e diversi kit commerciali forniscono anche i reagenti necessari ( soluzioni ) .
Di precipitazione e solubilizzazione

Proteine ​​non lo fanno sciogliere ( o " solubilizzare " ) e in soluzioni di alte concentrazioni di sale . Questa proprietà di solubilità sarà diverso tra le proteine ​​ed è un buon modo per distinguere tra quelli strettamente correlati . Da una soluzione di diverse proteine ​​, quantità crescenti di sali come il solfato di ammonio può essere utilizzato per frazionare e precipitare le proteine ​​più grandi prima (A bassi livelli di solfato di ammonio ) , e quindi anche di concentrare campioni molto diluiti . Questo è il metodo più comunemente utilizzato per la sua semplicità .
Cromatografia

Questo include gel - filtrazione , scambio ionico , affinità e cromatografia liquida ad alta pressione ( HPLC ) . In tutti i casi , il lisato è permesso di fluire attraverso una colonna contenente microsfere porose di caratteristiche diverse , ma fisse. Cromatografia di gel - filtrazione per separare piccole proteine ​​da quelli più grandi , utilizza perline realizzati con materiali come il destrano , poliacrilamide o agarosio . Cromatografia a scambio ionico separa le proteine ​​da netti di carica utilizzando perline che hanno i gruppi carbossilato su di loro . Le proteine ​​che si attaccano ai talloni vengono mantenuti , mentre quelli che si legano debolmente o flusso tutto dritto e sono raccolti fuori l'altra estremità della colonna . È anche possibile recuperare la proteina che è stata legata . Questo approccio viene utilizzato in cromatografia di affinità , che sfrutta l'affinità di una proteina di specifici ligandi chimici . L' proteine ​​viene lavato via dalla colonna inondando le perle con una soluzione per diminuire il legame . HPLC è una risoluzione più alta , più veloce e versione molto migliorata del - cromatografia .
Ultra - centrifugazione

Soluzioni di proteine ​​di varie masse o densità può essere separato in base al tempo necessario per affondare o sedimentare sul fondo di un tubo durante la centrifugazione . Particelle più pesanti e /o dense saranno pellet prima , mentre rimarranno disciolto quelli più leggeri o meno densi . Separazione delle proteine ​​viene effettuata in una soluzione contenente un strati di aumentare o diminuire la concentrazione di materiale, come saccarosio o altri mezzi di comunicazione , come Percoll . Ultracentrifugazione in questo " gradiente di concentrazione " permette la separazione di proteine ​​di grandi dimensioni da quelle più piccole . Sia il pellet e il surnatante ( contenente le proteine ​​più piccole ) possono essere raccolti per ulteriore purificazione e analisi .
Conclusione

I buoni metodi di isolamento produrrà grandi quantità e di alta purificazione proteine ​​, e in ogni caso , i successivi requisiti sperimentali dovrebbero essere prese in considerazione quando si seleziona il metodo più appropriato da utilizzare . Buone risorse per ulteriori dettagli e protocolli precisi sono Clive Dennison di ' Una guida alle proteine ​​Isolation ' ( Kluwer , 2003) e Hafiz Ahmed di ' Principi e reazioni di proteine ​​di estrazione , purificazione e caratterizzazione ( CRC Press , 2005) . Tuttavia la maggior parte dei protocolli e dei laboratori professionali usano sviluppata commercialmente kit che consistono in misure tecniche semplici ed efficaci , ma ancora più importante , di elevata purezza , per l'isolamento delle varie classi di proteine ​​.