Come estrarre Invitrogen Trizol RNA

estrazione TRIzol di acido ribonucleico ( RNA ) è un metodo collaudato ed efficace per qualsiasi numero di tessuti cellulari e tipi . Ulteriori passaggi opzionali possono essere aggiunte per ottimizzare l'estrazione di alcuni tessuti vegetali recalcitranti , ma la maggior parte delle cellule daranno il loro RNA a questo metodo . RNA estratto da questo metodo è di solito di alta qualità per ulteriori reactions.Things enzimatici che ti serviranno
Cloroformio
isopropanolo
Pipettes
Omogeneizzatore
Centrifuga
Scala
Mostra Altre istruzioni
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omogeneizzare 50 a 100 milligrammi (mg) di tessuto in 1 millilitro ( ml ) di TRIzol reagente con un vetro - teflon o potere omogeneizzatore per rilasciare l'RNA . Il metodo varia in cellule cresciute in monostrato o in sospensione ; in questi casi la lisi cellulare può essere realizzato attraverso il pipettaggio più volte invece
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Isolare le proteine ​​in eccesso , grassi , polisaccaridi e tessuti vegetali con la seguente fase di centrifugazione optional : . Spin vostri tubi nella centrifuga in un ambiente di non più di 12.000 RCF (forza centrifuga relativa ) per 10 minuti ad una temperatura di 2 a 8 gradi Celsius ( C ) . Rimuovere qualsiasi strato di grasso superiore e scartare . Il surnatante risultante conterrà l'RNA ; rimuovere questo in una nuova provetta e scartare il pellet .
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Incubare il campione omogeneizzato per cinque a 10 minuti a temperatura ambiente ( da 15 a 30 gradi Celsius ) . Quindi aggiungere 0,2 ml di cloroformio per 1 ml di TRIzol . Tappare la provetta e agitare a mano per 15 secondi . Incubare di nuovo --- per due o tre minuti a temperatura ambiente --- e poi centrifugare a non più di 12.000 rcf per 15 minuti a 2-8 ° C. La miscela deve essere ora in tre fasi : una più bassa rosso , fenolica fase cloroformica ; un interfase ; e una fase superiore incolore chiamata fase acquosa . Estrarre la fase acquosa in una nuova provetta --- questa fase tiene l'RNA .
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Aggiungere 0,5 ml di alcool isopropilico per 1 ml di TRIzol alla fase acquosa e poi incubare per 10 minuti a 15 per 30 ° C. Seguire l'incubazione con centrifugazione a non più di 12.000 rcf per 10 minuti a 2 e 8 ° C. Si dovrebbe essere in grado di vedere un RNA a pellet simil-gel sul fondo della provetta .
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scartare il surnatante pipettando con cautela . Asciugare il pellet di RNA per cinque a 10 minuti, ma non asciughi completamente o non sarà in grado di risospendere esso . Sciogliere il pellet in acqua RNase-free o 100 per cento formammide deionizzata, mescolando con una pipetta e poi incubando per 10 minuti a 55-60 ° C.
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Conservare a -70 ° C.