Un tutorial per PCR Primer design

Il design della reazione a catena della polimerasi ( PCR ) primer è una capacità che tutti gli scienziati biologici devono padroneggiare . PCR è una procedura sperimentale ampiamente utilizzato per amplificare segmenti di geni e generare migliaia di copie per ulteriori analisi scientifica . Primer PCR sono brevi frammenti di DNA , chiamati oligonucleotidi , progettati appositamente per riconoscere e ibridare ad un segmento di DNA all'interno di un pezzo molto più grande . Questo permette ad altri acidi nucleici forniti nella miscela di reazione PCR per legarsi al fondo , e la sequenza di DNA bersaglio riconosciuto a diventare amplificato . Istruzioni
un tutorial per PCR Primer design
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Sempre alla ricerca di primer esistenti . Controllare riviste scientifiche e banche dati di primer , ad esempio , primerdb , per le sequenze dei primer che sono stati utilizzati in altri esperimenti e scientificamente dimostrato di lavorare esistente . Purtroppo , perché il design primer e reazioni di PCR sono processi difficili , scienziati professionisti tendono ad usare primer e parametri di reazione che sono già state pubblicate e sperimentalmente validati .
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Trova un software di progettazione primer. Uno dei più antichi e più usato è Primer3 , che è liberamente disponibile come strumento pagina web . Altri includono oligocalc , OLIGO 7 , PrimerQuest o OligoAnalyzer . Preferibilmente , questo avrebbe dovuto essere uno strumento consigliato a voi da uno scienziato senior attualmente in uso , perché tutto il software di progettazione di primer avrà sfide tecniche e richiedono la risoluzione dei problemi da parte di un esperto biologo molecolare . Carica la tua sequenza del gene bersaglio nel formato , ad esempio , FASTA o testo , specificato da qualsiasi software viene utilizzato .
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Selezionare la sequenza all'interno del vostro gene bersaglio prescelto , noto come il ' modello. ' Guardate la sequenza delle varie regioni scelte per la struttura secondaria ( regioni di sequenza che si piegano e si legano ) ed evitare questi , ove possibile . Evitate anche le regioni con più di quattro basi uguali consecutivi , vale a dire , ripete . Infine , assicurarsi che il GC corrente , o guanina - citosina , contenuto non supera il 60 per cento .
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Eseguire il software di progettazione primer. Specificare una lunghezza di primer di 18 a 24 nucleotidi . Impostare parametri quali temperatura di fusione da 55 a 80 gradi Celsius , contenuto di GC del 40 al 60 per cento . Posizionare un ' clamp GC ' al 3'end della sequenza di innesco digitando manualmente in una serie di ' G ' o nucleotidi 'C ' . Aggiungere o rimuovere la ' G ' o basi 'C ' fino a quando la temperatura di fusione è accettabile .
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Eseguire i controlli finali . Questi controlli dipendono dalla finalità originaria della PCR per i quali i primer sono stati progettati . È possibile verificare per l'auto - ibridazione o la formazione di primer -dimero , strutture tornante o specificità di sequenza . Ad esempio , se la PCR è di rilevare le mutazioni di singole basi , allora è necessario verificare che il vostro fondo riconosce solo il modello amplificato .