Microscopia a fluorescenza protocolli

Una sostanza fluorescente illumina quando sono eccitati dalla luce di una specifica lunghezza d'onda . Fluorescenza si verifica naturalmente in alcune sostanze come la clorofilla , ma la maggior parte hanno bisogno di collegare sonde fluorescenti chiamati fluorocromi , o essere trattata con una sostanza chimica fluorescente. Fluorescenza viene utilizzato per preparare alcune strutture biologiche per il rilevamento e l'analisi al microscopio . Microscopio fluorescente

Il microscopio a fluorescenza opera filtrando attraverso unica luce con una lunghezza d'onda specifica per il campione fluorescente , di solito da un mercurio o lampada allo xeno . La luce si scontra con il campione , e gli elettroni si eccitano e passare ad un livello più alto orbitale . Come gli elettroni ritornano al loro livello normale , l'energia della luce viene emessa . Questo è meno luminosa con una lunghezza d'onda più lunga della luce di eccitazione originale , ed è resa visibile mediante l'uso di un secondo filtro nel microscopio che separa la luce emessa dalla luce di eccitazione originale .
Fixation

campioni sono prima preparati prima di essere visualizzato su un microscopio a fluorescenza . Per le cellule e tessuti , questo è fatto da fissazione. Fissaggio permette l'organizzazione strutturale del campione deve essere mantenuta prima della colorazione con una sonda fluorescente . La tecnica di utilizzo fissazione dipende da fattori quali il tipo di sonda fluorescente utilizzato , e la dimensione o spessore del campione . Ci sono diverse tecniche di fissazione , tra cui precipitazioni , cryofixation e cross -linking
Fixation - . Cross-linking

Cross- linking è una tecnica di fissaggio comune , in cui viene aggiunto un reagente che si lega ai componenti intracellulari del campione . Aldeidi come paraformaldeide e glutaraldeide sono comunemente usati come reagenti fissa , e formano legami covalenti con i gruppi amminici del campione , tramite la reazione acido- base di Schiff . Aldeidi sono considerate un cancerogeno e devono essere trattati all'interno di una cappa aspirante. Reagenti reticolanti sono generalmente disciolti in un tampone appropriato come tampone fosfato salino ( PBS ) , che aiuta a mantenere la cella vicino al suo stato fisiologico normale senza interrompere la sua struttura cellulare . Buffer - ammina contenente non sono raccomandati perché si legano al reagente di reticolazione .
Colorazione

fluorocromi sono generalmente progettati intorno , composti organici aromatici che si legano al biologico campione . In campioni di cellule , fluorocromi monitorare anche la vitalità cellulare , tra cui l'apoptosi , la fluidità di membrana , endocitosi , esocitosi e l'attività enzimatica . Fluorocromi comuni utilizzati in microscopia a fluorescenza sono rodamina e macchie Hoechst . Rodamina è utilizzato per etichettare una gamma di molecole biologiche , tra cui gli acidi nucleici , proteine ​​, lipidi , carboidrati , ormoni e tossine . Rodamina ha una fotostabilità alta , estinzione, resa quantica fluorescente , e un basso grado di formazione di tripletto . I due tipi di macchie Hoechst , 33258 e 33342 , sono utilizzati principalmente per etichettare DNA . Essi possono essere utilizzati per colorare le cellule viventi , e possono anche visualizzare mitocondri e nuclei . Macchie Hoechst interrompere la replicazione del DNA durante la divisione cellulare come risultato del legame loro DNA e sono quindi considerate cancerogene e mutagene .