Come costruire vettori di espressione

A genoma umano consiste di 3 x 10 ^ 9 paia di basi in 24 cromosomi , ma non tutti di questa informazione genetica viene utilizzato . Le regioni attive del genoma sono denominate " geni ", che contengono le informazioni utilizzate per produrre proteine ​​. Un gene è trascritto da acido ribonucleico messaggero ( mRNA ) , che alla fine viene tradotto dai ribosomi in proteine ​​.

vettori di espressione sono utilizzati nel settore delle biotecnologie per la produzione di molte copie di una specifica proteina . Per esempio , l'insulina usata per trattare il diabete è di massa, attraverso l'ausilio di vettori di espressione . Istruzioni
Costruire un Expression Vector
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Determinare la sequenza di DNA della proteina specifica. Una volta che la sequenza di DNA della proteina è determinata , tagliare la sequenza di DNA dal genoma utilizzando uno specifico enzima di restrizione . Enzimi di restrizione riconoscere e tagliare a una specifica sequenza del genoma .
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Inserire il DNA specifico nel vettore . Un vettore è una molecola di DNA che introduce DNA estraneo in una cellula ospite , utilizzando enzimi della cellula per produrre la proteina dal DNA estraneo .
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Inserire una sequenza promotrice a valle del gene di interesse . Un promotore è una regione che è riconosciuto dalla RNA polimerasi , che si lega alla sequenza e inizia la trascrizione del gene . Aggiungere l'enzima ligasi per fissare la sequenza di promotore per il gene di interesse .
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Inserire il vettore di espressione in una cellula ospite mediante trasformazione , inducendo fori transitori (utilizzando sale) nella membrana cellulare . Il vettore di espressione può essere trascritto da mRNA e tradotto in proteina .
Screening per Expression Vector
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Eseguire un test di screening per determinare se la cellula ospite ha il vettore di espressione . La cellula ospite viene prima placcato con la tecnica asettica ( passando apparecchiature mediante una fiamma ) su una piastra di agar per cella crescita della coltura .
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anticipato alcune cellule dalla piastra di agar su un disco di carta di nitrocellulosa . Abbattere le celle nel disco trattandoli con sale . Questo rilascerà il contenuto della cella sul disco.
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Immergere il disco di carta di nitrocellulosa con una soluzione di una sonda anticorpo specifico con un tag fluorescente . L'anticorpo si lega alla proteina prodotta dal DNA di interesse .
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Esporre il disco di carta di nitrocellulosa ai raggi UV . Se la cella ha il vettore di espressione , la cella fluorescenza sotto luce UV a causa del legame del prodotto proteico con l'anticorpo con un tag fluorescente
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Estrarre il prodotto proteico mediante metodi di purificazione . ; può quindi essere utilizzata per scopi medicinali .