Come fare una linea cellulare stabile

celle stabili linee sono cellule ingegnerizzate in laboratorio per esprimere sempre un certo cellule gene.These aiutano gli scienziati conducono analisi della funzione genica , la scoperta e convalida del target , sviluppo di analisi e di screening composto. A seconda del tipo di espressione genica e il costrutto gene ( chiamato anche un plasmide ) , ci sono molti approcci diversi per stabilire lines.Things cellulari stabili che vi serve
Cells
Transfezione reagente
plasmidi DNA con neomicina gene
G418 antibiotico

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clonare il gene in un plasmide che codifica un gene di resistenza agli antibiotici ( neomicina : neo ) . Se il DNA plasmide non ha questo gene , è possibile co- trasfezione un altro plasmide con il gene neo . ( La trasfezione è l'introduzione di DNA in una cellula ricevente e successiva integrazione del DNA nel DNA cromosomico della cellula del destinatario . ) Importanza di un gene di resistenza agli antibiotici è che dopo la trasfezione , le cellule che non hanno il DNA plasmidico moriranno , e solo le cellule che hanno crescerà in terreni di crescita - antibiotico ricco .
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crescere le cellule che devono essere fatte stabile per accedere fase . Questa fase è quando il numero di cellule in un mezzo di coltura aumenta in maniera esponenziale .

È necessario circa 1 milione di cellule per trasfezione . Questi devono essere cellule aderenti , che sono quelle che attribuiscono al piatto di coltura tissutale .
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Piastra 1 milione di cellule nel 10 centimetri piatto di coltura tissutale 24 ore prima della trasfezione .

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giorno successivo dopo la placcatura , trasfettare 10 microgrammi di DNA nelle cellule usando il reagente di trasfezione .
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Settantadue ore dopo la trasfezione , utilizzare tripsina , un enzima , per rimuovere l' cellule dal piatto di coltura tissutale ( chiamato anche " trypsinizing " ) . Replate le cellule in sei piastre di coltura tissutale . I media la crescita dovrebbe avere G418 antibiotico per la selezione neomicina .
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Ci vorranno quasi due settimane per le cellule a crescere . Continuano a cambiare i mezzi di crescita con G418 o altro tipo di antibiotico .
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volta , le cellule hanno raggiunto il numero massimo che può crescere nel piatto di coltura tissutale , trypsinize e replate in diluizioni . Utilizzando un anticorpo adatto , è possibile raccogliere alcuni di loro per confermare la presenza del gene di interesse specifico .