Come utilizzare una colonna a fase inversa per la prima volta

cromatografia a fase inversa , o RPC , è utilizzato per purificare proteine ​​ed altre molecole che formano interazioni idrofobiche con la matrice colonna , detta anche fase solida . La colonna viene lavata ed equilibrata con un solvente acquoso che facilita il legame della molecola idrofobica campione con la matrice colonna idrofoba . La molecola campione può essere eluito forma colonna aumentando l'idrofobicità del solvente acquoso aggiungendo gradualmente solvente organico nel solvente acquoso . Per purificare con successo la vostra proteina , è essenziale che si stabilizzi , lavare e eluire correttamente la colonna. Istruzioni
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Prepara il tuo colonna a fase inversa da equilibrare con 10 volumi di colonna di soluzione di lavaggio . Questo è in genere noto come tampone o solvente A. tampone A è un solvente a base acquosa con 0,1 per cento di acido . Lo stesso tampone A viene utilizzato , insieme con l'organico tampone B , per eluire il campione . Acido formico , acido trifluoroacetico o acido acetico sono comunemente usati per fare tampone A. Assicurarsi soluzione allo 0,1 per cento con l'aggiunta di 1 ml di acido in 1 litro d'acqua .
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Applicare il primo campione nella colonna. Preparare il campione diluendolo nel buffer A.
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Lavare la colonna con 5 volumi di colonna di 100 per cento del buffer A. Questo aiuta a lavare tutte le molecole extra nel campione che non vincolano alla colonna , lasciando solo il campione molecola si legano dietro .
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eluire il campione aumentando gradualmente l'idrofobicità della soluzione di eluizione . Questo si ottiene mescolando gradualmente tampone A e B insieme tampone . Inizia con il 99 per cento tampone A e 1 per cento tampone B e aumentare gradualmente la quantità di tampone B e diminuire la quantità di tampone A. Al termine del gradiente , la soluzione di eluizione è 0 percento tampone A e 100 per cento tampone B.

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Raccogliere tutto il solvente che esce dalla colonna dopo si inizia l'eluizione . Questo è solitamente fatto raccogliere qualche frazione millilitri in piccoli tubi . In questo modo non perderete il vostro campione , se non si sa a che ora concentrazione del tampone punto B eluisce dalla matrice colonna. La maggior parte delle macchine cromatografici sono dotate di uno spettrometro che analizza ogni frazione per le proteine ​​. Eliminare tutte le frazioni che non contengono proteine ​​e salvare solo le frazioni che sono positivi per le proteine.
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Lavare la colonna con 10 volumi di 100 per cento tampone A dopo aver eseguito l'intero gradiente di eluizione . Dopo questo , la colonna è pronto per il secondo campione o da rigenerare e preparata per lo stoccaggio .