Come passare IgG sottoclassi

Immunoglobulina G , o IgG , è un anticorpo realizzato da B - linfociti . Gli anticorpi sono importanti per l'immunità e vi aiutano a difendere contro i microbi patogeni e tossine. Anticorpi monoclonali IgG di topo sono comunemente prodotte in laboratorio in linee cellulari di ibridoma e utilizzati per diverse applicazioni mediche . I topi hanno quattro sottoclassi di IgG : IgG3 , IgG1 , IgG2b e IgG2a , chiamati nell'ordine in cui si verificano nel DNA . Un anticorpo IgG3 può passare in modo casuale a IgG1 , che può commutare in modo casuale a IgG2b e così via . Questa commutazione casuale può essere utilizzata per isolare e produrre tutti i quattro sottoclassi di IgG da ELISA posto , come prima descritto in uno studio pubblicato nel "Journal of metodi immunologici . " Le cose che ti serviranno
Sterile cellule attrezzature e reagenti cultura
IgG3 secernenti linea cellulare
piastre ELISA e reagenti
anti-topo anticorpi IgG , senza etichetta e HRP - marcato
Incubatore
Hood
Mostra Altre istruzioni
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crescere il vostro anticorpi IgG3 genitori nella linea cellulare di ibridoma . Inizia con la sottoclasse IgG3 per ottenere tutti e quattro sottoclassi . Commutazione sottoclasse avviene nell'ordine geni IgG verificano nel DNA . Una volta che la linea cellulare passa da una sottoclasse all'altra , la prima ( parentale ) gene sottoclasse viene perso dal DNA . Commutazione sottoclasse non può avvenire in ordine inverso .
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Piatto della linea cellulare IgG3 in una piastra a 96 pozzetti di coltura cellulare sterile , 1.000 cellule per pozzetto in 200 mcl . Crescere per una settimana . Harvest 100 mcl dei media e testarlo con un saggio ELISA .
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Coat 96 - e le piastre ELISA con un marcato capra anti-topo IgG1 anticorpo in tampone fosfato salino --- PBS . Aggiungere i media e incubare 1 1/2 ore . Lavare le piastre con PBS e aggiungere l'anticorpo secondario marcato --- HRP di capra anti - topo anticorpo IgG1 . Incubare per 1 1/2 ore. Lavare poi con PBS . Aggiungere substrato HRP e incubare per 30 minuti . Aggiungere la soluzione di arresto e leggere con un lettore di piastre ELISA a 450 nm .
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Trova ogni IgG1 - positivo bene alla piastra di coltura cellulare originale . Raccogliere le cellule da questi pozzi e piastra 100 cellule per pozzetto in un piatto di coltura cellulare da 96 pozzetti . Piatto cinque a 10 piastre totale. Grow per una settimana e ripetere il test ELISA .
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cellule piastra dal positivo anche ad una nuova piastra di coltura cellulare da 96 pozzetti in una cella per bene. Piatto cinque a 10 piastre totale e crescere per due settimane . Schermo ogni bene su base giornaliera per la crescita cellulare e segnare i pozzi che mostrano una colonia singola cellula . Questo farà sì che la linea cellulare - IgG1 produzione proviene da una singola cellula ed è identico . Ripetere il test ELISA .
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Ripetere la one- cell - per- bene placcatura dai pozzi positivi. Ripetere il test ELISA .
Cellule Harvest IgG1 - positivi 7

e farle crescere in una piastra da 24 pozzetti . Inoculare in un matraccio da 25 ml , 75 ml matraccio e infine in un pallone da 125 ml . Una volta che hai una popolazione di cellule stabile , crescere in un bioreattore ibridomi per la produzione di massa .
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rifare l'intero protocollo a partire dalle cellule IgG1 produzione per ottenere una linea cellulare IgG2b - produzione . Una volta che hai la linea cellulare IgG2b , ripetere l'intero protocollo ancora una volta per ottenere la linea cellulare - IgG2a produzione . Fare i test ELISA con un anti- topo IgG2b o IgG2a anticorpi , invece di IgG1 , a seconda di quale sottoclasse che si stanno isolando .