Come identificare una glicoproteina Attraverso un reagente Bradford

glicoproteine ​​sono proteine ​​con carboidrati ad essi connessi. Come per tutte le proteine ​​, è possibile utilizzare il reagente di Bradford per determinare se glicoproteine ​​sono in una soluzione e calcolare la loro concentrazione. Il reagente di Bradford è un colorante che forma un complesso tra le proteine ​​in soluzione e il reagente blu brillante G , causando tutti e tre da abbinare . Il complesso , se letta con uno spettrometro , si assorbe luce di un massimo di 595 nm , invece di 465 nm , che è la lunghezza d'onda alla quale reagente di Bradford da sola assorbirebbe . La quantità di assorbimento è proporzionale alla quantità di proteine ​​( o glicoproteina , come il caso ) nei solution.Things che ti serviranno
spettrofotometro Luce
piatto Assay
Micropipette
Mostra Altre istruzioni
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Scaldare lo spettrofotometro . Accendere e lasciare in posa per almeno 15 minuti prima dell'uso .
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Preparare "standard" nel piatto test . Le norme sono soluzioni contenenti quantità note della glicoproteina per cui vi sarà il test del composto sperimentale . Ottenere letture di assorbanza per questi standard noti , e successivamente una curva di calibrazione che appezzamenti conosciuti concentrazione contro assorbanza , vi permetterà di quantificare la quantità di proteine ​​nei tuoi campioni incogniti .

Per preparare i vostri standard , compila tutti i 12 pozzi una riga di una piastra di saggio con 100 microlitri di acqua distillata , usando una micropipetta . Per il primo bene , aggiungere 100 microgrammi di glicoproteina pipettando . Utilizzare una micropipetta per mescolare completamente la glicoproteina e acqua distillata insieme : pipetta su e giù . Questo primo pozzo , più concentrata contiene un rapporto di 50 microgrammi di glicoproteina di 50 microgrammi acqua . Togliere 100 microlitri di liquido misto a quel primo bene e pipetta nel secondo pozzo . Mescolare accuratamente pipettando su e giù . La concentrazione di questo secondo pozzo è di 25 microgrammi glicoproteici a 50 microgrammi di acqua . Togliere 100 microlitri dal pozzo secondo , pipetta nella terza bene e ripetere la procedura per tutte le successive pozzetti della fila fino a raggiungere l'ultimo bene . L'ultimo bene dovrebbe consistere solo di acqua distillata e hanno 0 microgrammi di glicoproteina , quindi non pipettare nell'ultima bene .

In altre parole , ciascuno dei pozzetti standard, dovrebbe avere 100 microlitri di fluido al loro interno e dovrebbe diminuire , nel contenuto glicoproteina , metà ogni volta , da 50 microgrammi a 0 microgrammi .
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Mettere 100 microlitri di vostro composto sconosciuto in un pozzo vuoto del piatto test. Non è necessario diluire il bene sconosciuta , perché non hai bisogno di una curva di calibrazione dallo sconosciuto . Pertanto , ogni sconosciuto che si sta verificando per le glicoproteine ​​richiede un pozzetto della piastra di dosaggio unico . Il tuo sconosciuta dovrebbe contenere una stima compresa tra 5 e 100 microgrammi di glicoproteina . Questa stima aumenta la probabilità che le letture di assorbanza del vostro sconosciuto cadranno sulla curva di calibrazione che si ottiene dai vostri standard .
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Aggiungi tintura e reattivo , in quantità indicate dal fabbricante kit di reagenti , per le norme e le incognite . Attendere cinque minuti per consentire la formazione del complesso .
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Leggere l'assorbanza di entrambi gli standard e le incognite nella spettrofotometro . Dalle norme , di ottenere una curva di calibrazione valori di assorbanza contro concentrazione nota . Lo spettrofotometro dovrebbe formulare automaticamente per voi , ma se non , fare il vostro proprio curva . Utilizzando un programma di grafica --- o graficamente i valori di assorbanza carta --- trama sulla ascisse e concentrazione nota sulla y. Montare una linea best-fit della curva di taratura per ottenere il rapporto tra assorbanza e concentrazione .
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Collegare i valori di assorbanza prime per i campioni sconosciuti nel tuo formula curva di calibrazione , per ottenere la concentrazione della glicoproteina nel campione .