Come esprimere geni procarioti in Eukaryotics

cellule procariotiche si trovano prevalentemente nei batteri e di archeobatteri . Sono costituiti da diverse molecole biologiche , compreso il DNA , proteine ​​ed enzimi circondato da una membrana cellulare semplice . Queste molecole svolgono tutte le funzioni biologiche della cellula . Una cellula eucariotica è situato in impianti più complessi e animali . Esso contiene organelli cellulari o organi , ciascuno responsabile di una specifica funzione biologica . Tutti gli organelli sono circondati da una membrana cellulare complessa e parete cellulare . I geni, che comunemente comprendono segmenti di DNA , sono stati spesso trasferiti tra le cellule procariotiche e eucariotiche come parte dell'evoluzione della natura . Lo stesso può essere dimostrato in laboratorio con tecniche di trasferimento genico come la trasformazione e transfection.Things che ti serviranno
Escherichia coli cultura
Lauria brodo
inoculazione ciclo
Incubatore
1 ml di detersivo o shampoo chiarire bagno
acqua Hot News alcool freddo
papaina estrae
293 cellule T
Dulbecco Modified Eagle Medium o DMEM
cloruro di calcio
HEPES - buffered soluzione salina

Mostra Altre istruzioni
1

Aggiungi un ciclo pieno di cultura E.coli alla sterile Lauria brodo in una provetta utilizzando un ciclo inoculazione sterile . Incubare la provetta a 37 gradi centigradi per 24 a 36 ore .
2

Mix 5 ml di soluzione di E. coli a 1 ml di detersivo in una provetta e posto in un bagno di acqua calda a 55 a 60 ° C per 10 minuti. Questo libererà il DNA dalle cellule batteriche . Aggiungere estratti enzimi papaina alla provetta e metterlo in bagno d'acqua calda per altri 20 minuti . Questo rimuoverà proteine ​​indesiderate allegati al DNA .
3

Aggiungere alcool freddo alla soluzione per creare uno strato di circa 1 centimetro sulla parte superiore della soluzione batterica . Lasciate che la soluzione riposare per 2-3 minuti. Il DNA si precipita in soluzione alcolica .
4

crescere un monostrato delle 293 T cellule in DMEM a 37 gradi Celsius . Questo dovrebbe essere fatto 24 ore prima del processo di trasfezione .
5

Miscelare 10 microgrammi di DNA a 61 microlitri di cloruro di calcio e 0,5 ml di acqua distillata . Aggiungere la soluzione a 0,5 ml di soluzione fisiologica HEPES - buffered , mescolando delicatamente aggiungendo .
6

Aggiungi questa miscela alle 293 linee di cellule T e incubare a 30 gradi centigradi per 16 a 24 ore. Il calcio carica positiva e il fosfato carico negativamente combinano con il DNA ed entrano nelle cellule eucariotiche . Questo metodo comunemente porta alla sola espressione a breve termine dei geni trasferiti .