cromatografia liquida ad alta pressione ( HPLC ) è un processo cromatografia utilizzato nella separazione e purificazione dei campioni . Si tratta di una tecnica di separazione liquido – solido in cui la separazione di una miscela si basa sulla affinità della sostanza polare del liquido tampone , o l’ adesione della sostanza non polare nella colonna , altrimenti noto come ” simili dissolvono i simili . ” HPLC è un metodo rapido e sensibile per la separazione , come ogni esecuzione richiede solitamente 30-60 minuti , a seconda delle dimensioni e del tipo di colonna utilizzata , mentre assorbanze del campione vengono rilevati da un computer. HPLC ha tipicamente una pompa solvente ad alta pressione per pompare il buffer attraverso il sistema , un iniettore per iniettare il campione nel sistema , una colonna , un rilevatore e un registratore di dati che è il programma eseguito sul computer collegato al sistema HPLC . Cose che ti serviranno
sistema HPLC e software campione
Protein
Buffer A
Buffer B
Siringa
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Preparazione
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Aliquote 20μl di campione in una provetta filtro rotativo e scioglierlo in 60μl del solvente , tampone A , che viene utilizzato all’inizio della corsa ( simili dissolvono i simili ) . Il filtro rotativo rimuove tutte le grandi particelle ( detriti , precipitare , ecc) che non possono dissolvere nel solvente , come la colonna consente solo di piccole dimensioni ( meno di 2μm ), particolato e filtra le particelle di grandi dimensioni . Questo potrebbe creare intasamento nel filtro colonna quando ci sono troppe grandi particelle per filtrare , creando una maggiore pressione nel sistema . Particelle più piccole nel sistema aumenta la risoluzione colonna del campione e visualizza un picco più distintivo.
Spin tubo a 10.000 rpm a 4 ° C per un minuto in una microcentrifuga . La preparazione del campione è importante per massimizzare la resa di eluizione e l’efficienza del sistema .
2
avviare il sistema accendendo il computer e il sistema HPLC . Il computer è connesso direttamente al sistema HPLC per ricevere dati dal rivelatore . Dopo che il computer riceve il segnale dal sistema , verrà aperto il programma HPLC .
3
Lavare il sistema con tampone A a 5ml/min per 20 minuti . Questo per evitare la cristallizzazione tampone intorno alle valvole e per lavare eventuali particelle rimaste nel sistema . Durante questo processo , controllare e stringere eventuali perdite e gocciolamenti per prevenire la perdita di pressione o di formazione di bolle . Controllare il livello del liquido di tampone A e B.
Campione Run
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Il sito di iniezione ha un interruttore che può essere capovolto manualmente tra ” Load” e ” Inject . ” Per la posizione ” carico” , iniettare il campione nel sito di iniezione con una siringa . Bolle possono formarsi al cilindro della siringa , che causerà picchi erranti che si hanno nel cromatogramma . Toccare la canna ed espellere le bolle . Altri metodi includono per sciacquare la siringa con un solvente più forte prima di caricare o ricaricare il campione nella siringa premendo e reprimendo con attenzione lo stantuffo per evitare più la formazione di bolle nel campione .
5
Digitare il campione informazioni nel programma prima di assaggiare correre per garantire i risultati sono associati con il campione corretto .
6
Capovolgere l’interruttore su ” Iniettare ” per l’esecuzione del programma e il campione inizierà a correre attraverso il sistema . Iniezione deve essere fatto rapidamente per evitare l’accumulo di pressione nel sistema . Il campione sarà gestito attraverso un sistema 5 -loop prima di andare alla colonna . Questo per garantire che il campione viene sciolto in tampone A prima di entrare nella colonna .
Ogni esempio di esecuzione richiede circa 28 minuti, in funzione del tipo di solvente e gradiente di pressione che è programmato per la corsa.
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Raccogliere il campione una volta un picco è visto nel programma. Questo sarà il campione che viene purificata dai composti che sono bloccati sulla colonna .
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Durante la seconda metà del ciclo di campionatura , il programma introdurrà un secondo buffer ( tampone B ) nella sistema per eluire le proteine ad alto abbondanti legato alla colonna . Vicino alla fine della corsa , tampone A viene reintrodotto nel sistema . Questo rigenera la colonna per la prossima corsa del campione .