DNA ricombinante ( rDNA ) si riferisce alla miscelazione di uno o più differenti filamenti di DNA per produrre un nuovo e del tutto sintetica uno . Una volta che il DNA ricombinante è stata inserita in una cella , la proteina ingegnerizzata viene poi espressa dalla cellula modificata . Il processo di modificazione genetica utilizzando rDNA è noto semplicemente come gene o ricombinazione ( o recombinatorial ) clonazione . Questo articolo è una breve panoramica dei passaggi necessari per la sofisticata tecnica scientifica della modificazione genetica utilizzando la reazione a catena della polimerasi per costruire rDNA.Things Hai bisogno

reagenti reazione a catena della polimerasi di amplificazione ( tamponi , enzimi , DNA stampo , primers ) e termociclatori

pipette

provette PCR o piastre

nucleico acido macchia ( ad esempio , bromuro di etidio , GelStar )

attrezzature gel elettroforesi ( agarosio , serbatoi , corsa buffer ) e tavolo luce UV

DNA reagenti legatura (ad esempio , DNA ligasi T4 e di reazione buffer , blocchi di calore )

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amplificazione e purificare il tratto di DNA di interesse : Utilizzare un protocollo di amplificazione che ha già stata valutata e ottimizzata per i reagenti PCR disponibili e specifiche al laboratorio . Preparare i reagenti della PCR , come primer e se fosforilare questi se legatura blunt – ended è il metodo di clonazione di scelta . Per la PCR , generalmente da 20 a 25 cicli di amplificazione con ibridazione per un minuto a 50 gradi Celsius sono sufficienti a produrre prodotti completi . Prendere 5 a 10 microlitri del prodotto di PCR ed eseguirlo su un gel di agarosio per visualizzare e confermare il formato del DNA . Recuperare e purificare i prodotti di PCR dalle tecniche di base di estrazione fenolo – cloroformio e precipitazione in etanolo

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enzimaticamente digest e repurify i frammenti di DNA : . L’utente deve già sapere cosa enzima di restrizione siti sono presenti all’interno del DNA amplificato prima di iniziare qualsiasi lavoro , e questi siti saranno utilizzati nella creazione di una digestione a « introdurre dei siti nudi ai frammenti . Utilizzare circa la metà del volume totale amplificato per questo e dopo la digestione , repurify i frammenti dal gel ed estrazione fenolo – cloroformio o altri metodi

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legatura del DNA e la transfezione cellulare : . Eseguire una esperimento ligazione del DNA per posizionare il frammento limitato entro un vettore che può essere trasfettato in una cellula batterica . Le cellule saranno trascrivere il nuovo gene ricombinante e produrre grandi quantità di esso . Crescere questi batteri e svolgere subcloning esperimenti per consentire la selezione di potenziali trasformanti

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Analizzare le sottocloni per confermare il gene modificato : . Dopo mini , vettori MIDI- , o maxiprepping il plasmide ( espressione ) , ripetere il processo di enzimi di restrizione e visualizzazione gel , e sequenziare il frammento amplificato per verificare che non siano presenti mutazioni .