Molte proteine ed enzimi nel corpo hanno la loro funzione modificato mediante l’aggiunta o la rimozione di un gruppo fosfato da un residuo di amminoacido nella proteina . I livelli di questi fosfoproteine sono transitori , e può essere difficile da misurare in un laboratorio di ricerca . Fosfoproteina può essere misurata rimuovendo la proteina da un ambiente cellulare mediante immunoprecipitazione , seguita dalla misurazione dei livelli fosfoproteina utilizzando un anticorpo sollevata contro la fosfoproteina rispetto alla proteina non fosforilata . Istruzioni
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Lisare le cellule riscaldandoli in un tampone di lisi . Anche se ci sono diversi tipi di buffer di lisi , tutti contengono detergenti la rottura delle membrane cellulari , prodotti chimici per inibire l’alterazione dei livelli di fosfoproteina , e sale e tamponi replicare l’ambiente interno della cellula per stabilizzare conformazioni proteiche.
2
Incubare il lisato in una soluzione contenente un anticorpo elevato alla proteina bersaglio . Per ottenere i risultati più affidabili , incubare in un siero contenente un eccesso di anticorpo . Questo può essere determinato eseguendo esperimenti di titolazione per misurare l’affinità di legame dell’anticorpo .
3
siero Incubare in una soluzione contenente un anticorpo secondario che si lega all’anticorpo utilizzato per indirizzare la proteina . Questo aggregare gli anticorpi e la tua proteina bersaglio in grandi ciuffi che possono essere facilmente rimossi dalla soluzione .
4
precipitare la proteina bersaglio facendo girare il siero incubati in una centrifuga . Rimuovere il liquido e asciugare il pellet rimanente per eliminare il siero in eccesso.
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Rileva la forma fosforilata della proteina bersaglio . Cercando di colpire solo la phosphoprotein usando immunoprecipitazione è imprecisa . Un metodo tipico è per dissolvere il pellet immunoprecipittion ed eseguire un western blot , un metodo in cui la proteina viene separata su un gel SDS – PAGE in peso molecolare , trasferito su una membrana di nitrocellulosa e riceva anticorpi per misurare i livelli di proteine specifiche .