Come progettare primer per la RT PCR

Reverse reazione a catena della polimerasi della trascrizione ( RT PCR ) fa copie di DNA di modelli RNA . Questo è opposto all'ordine naturale di copiare modelli di DNA per fare trascritti di RNA . E 'usato per fare una copia di DNA espressi " esone " sequenze di RNA - " . Introni " senza le intervenienti non trascritte Fare primer per RT PCR utilizza il fatto che gli introni sono esclusi dalla sequenza . Istruzioni
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Utilizzare sequenze di DNA reali per il confronto con il cDNA , che è più facilmente realizzabile utilizzando un computer . È necessario individuare le posizioni introni .
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Progetta la tua primer dal cDNA da sequenze esone che sarebbero situati su entrambi i lati di un introne nel vostro DNA . Nel modello cDNA , il primer sarebbe una sequenza dell'esone continua , mentre nel DNA primer sarebbe stato diviso da un introne . È possibile confermare l'amplificazione effettivo della sequenza cDNA in seguito , in quanto il fondo non sarà temprare di DNA contaminante perché l' introne interrompe il primer .
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Seguire i normali parametri di progettazione di primer oltre collocamento introne . In altre parole , si vuole evitare una sequenza che temprare a se stessa ( forma tornante loop ) o che si legano con l'altro fondo ( dimeri forma di primer ) .
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primer design in modo che siano da lungo 18-30 nucleotidi , con una temperatura di fusione tra 45-65 gradi Celsius . Evitare lunghe ripetizioni di basi e scegliere una sequenza con un contenuto di GC del 40-60 per cento . Assicurarsi che il 3 ' ( tre primo) fine non è troppo pesante in Gs e Cs per evitare multipla sito adescamento .