GST Tag Removal

Clonazione proteina con il glutatione S - transferasi sistema gene di fusione ( GST ) consente di purificare facilmente proteina utilizzando una cromatografia glutatione -coupled . Tuttavia, per ulteriori esperimenti , si consiglia di rimuovere la grande tag GST dalla vostra proteina . Questo può essere realizzato con un semplice trattamento proteasi che scinde largo della N - o C - terminale tag GST dalla proteina . La procedura può variare in base al sistema gene di fusione GST è stato utilizzato . Seguire sempre le istruzioni fornite nel manuale GST . Istruzioni
1

Sciogliere 500 unità di trombina in 500 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato freddo . Agitare delicatamente per fare la proteasi sciogliere . Questo rende una soluzione di trombina di 1 U /microlitro . Se si utilizza un altro proteasi , seguire le istruzioni indicate nel manuale GST
2

Mix 80 unità - . 80 microlitri - di trombina in 920 microlitri di tampone PBS per ogni millilitro di glutatione Sefarosio utilizzati nella vostra colonna . Ad esempio , se si è usato 2 millilitri di glutatione Sepharose per rendere la vostra colonna, utilizzare 160 microlitri di trombina e 1.840 microlitri di PBS . Se si utilizza un altro proteasi , seguire le istruzioni contenute nel manuale al momento della miscela di proteasi .
3

Applicare la miscela trombina nella colonna glutatione è già stato applicato il tuo GST tagged proteine. Il tag GST lega al glutatione , che tiene la vostra proteina all'interno della colonna . È inoltre possibile rimuovere il tag GST dopo aver eluito vostra proteina dalla colonna mescolando la vostra proteina con la miscela thrmobin in un tubo.
4

Sigillare la colonna e incubare a temperatura ambiente per 2 a 16 ore. Alcune proteasi possono essere incubate a 4 gradi Celsius . Seguire le istruzioni specifiche riportate nel manuale GST .
5

Lavare la colonna con 3 volumi di colonna di tampone PBS . Raccogliere il flow-through in alcuni tubi separati e analizzarli . Il flusso continuo contiene la proteina così come trombina , mentre il tag GST rimane vincolato nella colonna. Se si rimuove il tag GST in un tubo , la vostra proteina gratuita verrà mescolato con il tag GST e la trombina .