blotting Du Pont occidentale è una tecnica progettata per raccontare quante proteine ​​ha accumulato nelle celle selezionate . Utilizza elettroforesi su gel di proteine ​​denaturate dalla lunghezza della catena polipeptidica . La tecnica originale è stato sviluppato nel laboratorio di George Stark presso la Stanford University , ed è stato dato il suo nome da W. Neal Burnette . Tuttavia , Western Blotting non rileva con grande precisione quando una proteina degrada rapidamente . Scopo della tecnica

Indipendentemente dal fatto che la proteina in questione è stato sintetizzato in vivo ( naturalmente ) o in vitro ( in laboratorio ) , le tecniche di Du Pont Western Blot sono in grado di rilevare una proteina in un miscela di qualsiasi numero di proteine ​​. Essi forniscono informazioni circa la dimensione della proteina in questione . Il metodo è , tuttavia , dipende dalla fornitura di un anticorpo di alta qualità diretti contro la proteina desiderata . Una piccola porzione della proteina deve poter essere creata da un frammento di DNA clonato , e questo anticorpo è utilizzato per rilevare la proteina di interesse .

Svolgimento della Tecnica

in primo luogo , le proteine ​​devono essere separati da dimensioni attraverso l’uso della tecnica di elettroforesi su gel . Successivamente, una membrana di nitrocellulosa deve essere collocato sul gel , e l’ elettroforesi dovrebbe essere impiegato per azionare le bande proteiche sulla membrana di nitrocellulosa . Successivamente la membrana viene incubata con un anticorpo primario , che si attacca alla proteina , poi con un anticorpo secondario . Questo anticorpo secondario è usato come un coniugato anticorpo – enzima , ed è destinato a rispettare l’anticorpo primario . Le funzioni degli enzimi coniugati per aiutare a visualizzare ciò che sta avvenendo .

Rilevamento radioattivo

Nella tecnica Du Pont Western Blot , l’enzima clonato può essere visto in azione utilizzando il metodo di rilevamento radioattivo . In primo luogo , l’enzima clonato dovrebbe essere incubato in una miscela di reazione che è specifico per l’enzima . Se la procedura viene eseguita correttamente , bande dovrebbero diventare evidenti nel gel laddove la proteina è in evidenza . Un film di raggi X può essere posizionato sul gel per rilevare lampo di luce che si sprigiona dall’enzima .

Colorimetrico Detection

colorimetrico di rilevamento dipende dalla incubazione del Western Blot con un substrato progettato per reagire con l’enzima reporter legato all’anticorpo secondario . Ciò comporta la conversione del colorante solubile in una forma insolubile esibendo un colore diverso che macchia la membrana di nitrocellulosa .

Fluorescente Detection

Nel metodo di rilevazione fluorescente , un sonda marcata è eccitato dalla luce , e l’emissione di eccitazione viene successivamente rilevata da un fotosensore dotato di opportuni filtri di emissione . Questa cattura una immagine digitale del Western Blot e consente ulteriori analisi dei dati . E ‘considerato come uno dei metodi di rilevamento Western Blot più sensibili attualmente disponibili .

Blotting Agente

Prima di aggiungere l’anticorpo primario , il gel di nitrocellulosa deve essere incubato con una macchia . Albumina sierica bovina ( BSA ) è usato spesso , ma , forse sorprendentemente , Garofano senza grassi del latte secco rende uno dei migliori agenti blotting .