Un saggio di immunoassorbimento enzimatico ( ELISA ) è un test immunologico sensibile per rilevare la presenza di antigeni in campioni biologici . L’ ELISA utilizza anticorpi specifici collegati ad un enzima che è rilevabile attraverso l’uso di assorbimento passivo di luce . Ci sono due tipi comuni di ELISA : l’ ELISA diretta e Sandwich ELISA . Principi di base di un ELISA

ELISA utilizza antigeni che vengono assorbiti da pozzetti di piastre di microtitolazione in plastica , che vengono poi bloccato mediante un agente per coprire qualsiasi superficie aperta lasciato nel pozzo . Il tester aggiunge un anticorpo primario di aderire specifico all’antigene e quindi aggiunge un anticorpo secondario coniugato ad un enzima reattiva , di legarsi all’anticorpo primario . Il tester poi aggiunge un substrato cambio colore per visualizzare la concentrazione dell’antigene . Il colore del substrato aumenta insieme con la concentrazione dell’antigene .

Reagenti per ELISA

protocolli descritti in ” Methods in Molecular Biology ” richiedono i seguenti reagenti per l’ entrambi i tipi di ELISA : tampone di rivestimento di bicarbonato; PBS contenente albumina di siero bovino e Tween 20; tampone fosfato; tampone citrato; stop; Soluzione di lavaggio PBS e perossido di idrogeno . I protocolli descrivono ulteriormente composizioni e percentuali specifiche per ogni reagente .

Diretto ELISA

Aggiungi tampone carbonato a ciascun pozzetto di una micropiastra seguita da antigene diluito in un tampone di rivestimento bicarbonato . Incubare a temperatura ambiente per due ore o durante la notte . Lavare la piastra e lasciare asciugare a temperatura ambiente . Aggiungere rafano perossidasi coniugato ad ogni pozzetto , diluita a concentrazione appropriata , e lasciare incubare a temperatura ambiente per due ore supplementari . Aggiungere tampone di bloccaggio e lavare ogni pozzetto con la soluzione di lavaggio . Aggiungere tampone citrato a ciascun pozzetto e consentire lo sviluppo del colore . Dopo 10 minuti, fermare la reazione con il tampone di arresto . Misurare l’assorbanza con uno spettrofotometro .

Sandwich ELISA

Sulla base del lavoro di Munro e Lasley ( 1988) , il panino ELISA utilizza una perossidasi di rafano legante , antisiero e commerciale standard in una micropiastra a 96 pozzetti . I pozzetti della piastra sono rivestite con antisiero diluito in tampone di rivestimento bicarbonato . Sigillare piastre e incubare per 12 ore a 4 gradi Celsius . Diluire il coniugato enzima in tampone fosfato . Rimuovere l’anticorpo in eccesso con la soluzione di lavaggio e lasciare asciugare a temperatura ambiente . Dispensare tampone fosfato in tutti i pozzetti seguita da soluzione di coniugato contenente norme o campioni . Coprire le piastre per due ore. Lavare le piastre e lasciare asciugare a temperatura ambiente . Aggiungi tampone citrato a pozzi e far sviluppare il colore . Dopo 60 minuti , fermare la reazione con la soluzione stop. Misurare l’assorbanza con spettrofotometro .